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全量凱氏定氮法、微量凱氏定氮法和凱氏自動(dòng)定氮儀來測定了食品中的蛋白質(zhì)的含量
日期：2024-11-23 02:59
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摘要：
用凱氏定氮法測定食品中的蛋白質(zhì)含量 用凱氏定氮法測定食品中的蛋白質(zhì)含量 陳智慧1 史梅1 王秋香2 張曉紅2 (1.新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所 新疆 830063; 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 新疆 830052) [摘 要]為了更加**的運(yùn)用凱氏定氮法檢測分析食品中蛋白質(zhì)的含量,本文分別用全量凱氏定氮法、微量凱氏定氮法和凱氏自動(dòng)定氮儀來測定了食品中的蛋白質(zhì)的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用兩種方法對同一樣品中的蛋白質(zhì)含量得出數(shù)值高低不同,全量凱氏定氮法的結(jié)果更加**，微量法次之。 [關(guān)鍵詞]凱氏定氮法；**；含量；蛋白質(zhì) Method for determination of protein contentin foods WangQiu-xiang Astract: In order to more precise use of Kjeldahlmethod of detecting the protein content in food, we were in fullvolume Kjeldahl, trace Kjeldahl law and Kay's automatic instrumentto measure the nitrogen in food protein The content, and found twoways of the same protein content in the samples drawn high and lowvalues, all of Kjeldahl method more accurate results. Trace oftimes. Key words: Kjeldahl; accurate; content offood，Protein 前言 測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)來推算，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等；另一類是利用化學(xué)方法來計(jì)算，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑反應(yīng)等 主要測定方法有：雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法、紫外分光光度法、水揚(yáng)酸比色法、折光法、旋光法、近紅外光譜法. 目前蛋白質(zhì)測定*常用的方法是凱氏定氮法，是通過測總氮量來確定蛋白質(zhì)含量的方法。 凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量,此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量：由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物.凱氏定氮法是測定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測定多個(gè)樣品，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法[6]。至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法.此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法可分為全量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法目前通常以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時(shí)間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦[4]. 在理化實(shí)驗(yàn)室,檢驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)的含量通常用微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法.接下來以大量的試驗(yàn)來比較微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法的**度的大小. 1.材料與方法： 1.1試驗(yàn)材料 1.1.1試驗(yàn)樣品 肉禽制品(牛肉、馬肉、葷餃子餡) 豆制品(豆腐乳) 調(diào)味品(雞精) 乳制品(純牛奶) 糕點(diǎn)(面包) 植物蛋白飲料(椰汁) 冷飲及冰制品(雪糕、冰激淋) 1.1.2試驗(yàn)藥品和試劑 所有試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水。 硫酸銅； 硫酸鉀； 濃硫酸； 40％氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉溶于60mL蒸餾水中； 4％硼酸溶液：稱取4g硼酸溶于蒸餾水中稀釋至lOOmL； 0．1mol／L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液； 甲基紅次甲基藍(lán)混合指示液：將次甲基藍(lán)乙醇溶液(1g／L)與甲基紅乙醇溶液(1g／L)按1+2體積比混合。 1.1.3儀器和設(shè)備： 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器及下列各項(xiàng)： 凱氏燒瓶：500mL； 可調(diào)式電爐；蒸汽蒸餾裝置； 鉸肉機(jī)： 篦孔徑不超過4nm； 組織搗碎機(jī)； 粉碎機(jī)； 研缽：玻璃或瓷質(zhì)； 化學(xué)消化器， 空氣濾過器 1.2試驗(yàn)方法 1.2.1微量凱氏定氮法 微量凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后取消化液的1/10加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定[2]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個(gè)步驟 1.2.2全量凱氏定氮法 全量凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后取消化液的全部加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個(gè)步驟 2 分析過程 試樣制備：固體樣品：取有代表性的樣品至少200g，用研缽搗碎、研細(xì)；不易搗碎、研細(xì)的樣品應(yīng)切(剪)成細(xì)粒；干固體樣品用粉碎機(jī)粉碎；液體樣品：取充分混勻的液體樣品至少200g。粉狀樣品：取有代表性的樣品至少200g(如粉粒較大也應(yīng)用研缽研細(xì))，混合均勻；糊狀樣品：取有代表性的樣品至少200g，混合均勻；固液體樣品：按固、液體比例，取有代表性的樣品至少200g，用組織搗碎機(jī)搗碎，混合均勻；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的樣品至少200g，用鉸肉機(jī)至少鉸兩次，混合均勻。上述試樣應(yīng)放入密閉玻璃容器中，于4°C冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆茫M快測定。 2.1微量凱氏定氮法的分析過程 2.1.1樣品消化 : 步驟：準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)?！⌒囊迫敫稍餄崈舻?00ml凱氏燒瓶中(固體或粉末用紙卷成紙筒送入)，輕輕搖勻，以45o斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上→用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠(yuǎn)處)，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后→加大火力(或?qū)糠旁陔姞t上)，保持瓶內(nèi)液體微沸→至液體變藍(lán)綠色透明后→繼續(xù)加熱微沸30min→關(guān)閉電爐，取下燒瓶、冷卻→轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，加水定容 2.1.2 蒸餾與吸收： 按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準(zhǔn)確吸取消化液10mL于反應(yīng)管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水進(jìn)行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10min，將冷凝管**提離液面繼續(xù)蒸1min 2.1.3 滴定 將接受瓶內(nèi)的硼酸液用0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。 2.1.4 結(jié)果計(jì)算 式中 W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù) %； c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L； V1—空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； V2—試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； m—樣品質(zhì)量，g； 0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol； F—蛋白質(zhì)系數(shù)。 幾類常見食物的蛋白換算系數(shù)如下
計(jì)算結(jié)果**至小數(shù)點(diǎn)后**位。 同一試樣做兩次平行試驗(yàn)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。 2. 2全量凱氏定氮法的分析過程 2.2.1樣品消化 (同”微量法”) 2.2.2蒸餾與吸收 安裝好全量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在接受瓶中加入40ml40g/L硼酸及3滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。將全部消化液轉(zhuǎn)移于反應(yīng)管內(nèi)，加入125mL蒸餾水，搖勻后再加入40mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水進(jìn)行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10min，將冷凝管**提離液面繼續(xù)蒸1min 2.2.3滴定： 同“微量法”。 2.2.4計(jì)算 2.3 自動(dòng)凱氏定氮儀的分析過程 2.3.1樣品消化 準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、小心移人與化學(xué)反映器配套的消化管內(nèi),置于化學(xué)反映器上消化,同時(shí)打開空氣過濾器,預(yù)約消化溫度為410°C,預(yù)約時(shí)間為180分鐘.到達(dá)預(yù)約時(shí)間后,化學(xué)反映器自動(dòng)停止加熱,冷卻至室溫 2.3.2蒸餾、吸收、滴定、計(jì)算 打開凱氏定氮儀和冷凝水開關(guān),檢查機(jī)器與試劑的連接是否完好,將樣品的 質(zhì)量,和蛋白質(zhì)系數(shù)輸入系統(tǒng),把裝有冷卻消化液的消化管連接在凱氏定氮儀上,按下”ENTER”鍵,約五分鐘后,打印出此樣品相關(guān)信息的屏條,將直接顯示 樣品中蛋白質(zhì)的百分含量. 3.試驗(yàn)結(jié)果和分析 通過實(shí)驗(yàn)得到的蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)如下表：
分析： 微量凱氏定氮法所測定的樣品平行樣間平均差別為：0.1208 全量凱氏定氮法所測定的樣品平行樣間平均差別為：0.0353 微量凱氏定氮法的測定結(jié)果與自動(dòng)定氮儀的平均差別為：0.7697 全量凱氏定氮法的測定結(jié)果與自動(dòng)定氮儀的平均差別為：0.0523 4.討論 4.1通過比較傳統(tǒng)凱氏定氮法和凱氏自動(dòng)定氮儀所測定出的食品的蛋白質(zhì)含量可以看出,用傳統(tǒng)的凱氏定氮法所測定的蛋白質(zhì)含量比凱氏自動(dòng)定氮儀測出的結(jié)果偏低,前者兩次測定的同一食品的蛋白質(zhì)含量差別較后者大,即樣品的平行性平行性不夠好,精密度不高..是由于在傳統(tǒng)定氮的過程中存在著樣品消化液的轉(zhuǎn)移,在轉(zhuǎn)移的過程中有誤差的存在,導(dǎo)致消化液的流失,從而測定的數(shù)據(jù)稍偏低.差別較大 4.2通過比較傳統(tǒng)凱氏定氮法中的微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法可以看出,后者的數(shù)據(jù)高于前者,精密度高于后者,是由于前者在實(shí)驗(yàn)的過程中轉(zhuǎn)移的次數(shù)較多,誤差較大 4.3通過比較以上三組數(shù)據(jù)可以得知:凱氏定氮儀的的精密度*高,微量凱氏定氮法的*低;全量凱氏定氮法得到的數(shù)據(jù)和凱氏定氮儀的數(shù)據(jù)差別較小,準(zhǔn)確度高. 4.4量取的樣品倒入凱氏燒瓶時(shí)，不要將樣品粘在瓶頸上，以免加入消化液后試樣炭化粘在瓶頸上消化不徹底．消化過程中要逐漸升溫，當(dāng)?shù)蜏丶訙刂脸霈F(xiàn)帶有硫酸的白色氣體后，才可升溫使溶液沸騰，但應(yīng)避免劇烈沸騰。 4.5．消化液加蒸餾水稀釋后，應(yīng)及時(shí)蒸餾，否則應(yīng)保存消化液，臨用時(shí)再加蒸餾水稀釋．反應(yīng)室加入堿液后，應(yīng)立即蓋塞并加水封，注意各接頭處的密封情況，防止漏氣。 4.6．蒸餾時(shí)，加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外，還與消化液中的硫酸和硫酸銅作用．若加入的氫氧化鈉不夠，則溶液呈藍(lán)色，不生成褐色的氫氧化銅沉淀．所以，加入的氫氧化鈉必須過量，并且動(dòng)作還要迅速，以防止氨的流失。 4.7．蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水裝至三分之二體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，內(nèi)加甲基橙指示劑數(shù)滴，水應(yīng)呈橙紅色，如變黃時(shí)，應(yīng)該補(bǔ)加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出，使結(jié)果偏大。 4.8．因蒸餾時(shí)反應(yīng)至外層的氣壓大于反應(yīng)室內(nèi)的壓力，而反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時(shí)，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸餾中不得停火斷氣，否則，會(huì)發(fā)生倒吸。停止蒸餾時(shí)，由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應(yīng)室外層，所以，操作時(shí)，應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否完全，可用精密ＰＨ試紙測冷凝管口的冷凝液來測定，中性則說明已蒸餾完全。 5結(jié)論 5.1由于凱氏定氮法的誤差，主要因消化操作的條件而產(chǎn)生，因此要格外注意 5.2全量凱氏定氮法的準(zhǔn)確度和精密度比微量凱氏定氮法高,即**度高. 5.3凱氏自動(dòng)定氮儀的誤差較傳統(tǒng)的凱氏定氮法小,精密度高,因而**度*高. 5.4 在實(shí)際的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中，凱氏定氮法作為一種國家標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的分析試劑、用量及分析過程來操作 參考文獻(xiàn)： [1] 陸衛(wèi)明,尹華. 用蛋白質(zhì)測定儀測定食品中的蛋白質(zhì) [J];江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué); 2007年01期 [2] 姚軍,郝琳.凱氏氮/蛋白質(zhì)測定儀測定食品中蛋白質(zhì) [J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志; 2001年02期; 190. [3]張繼紅; . 自動(dòng)定氮儀測試技術(shù)在食品中蛋白質(zhì)測定的綜述評價(jià) [J];廣州食品工業(yè)科技; 2004年02期24 – 26. [4] 劉紅梅.新型蛋白質(zhì)測定儀測定食品中蛋白質(zhì) [J];預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志; 2003年03期; 84. [5] 王雪松, 曹德秋. 日常飲用的幾種牛奶中酪蛋白含量的測定[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2008,(03) 34 –36. [6]中國乳制品工業(yè)行業(yè)規(guī)范 RHB 601—2005 生鮮牛初乳[J]新疆畜牧業(yè),編輯部郵箱2006年 02期14 - 26. [7] 張蓉蓉 .乳品企業(yè)原料乳的驗(yàn)收與質(zhì)量控制 [J] 中國乳業(yè), 編輯部郵箱2006年 07期8 -20. [8] 尹家振 . 影響牛奶蛋白質(zhì)和脂肪含量的因素及調(diào)整措施 [J] 新疆畜牧業(yè),編輯部郵箱2006年 06期24 –36. [9]陳魏勇.冰淇淋品質(zhì)的**表現(xiàn)及其原因 [J] 農(nóng)產(chǎn)品加工編輯部郵箱2007年11期 [10]〔美〕Owen R.Fennema 著王璋，許時(shí)嬰，江波，楊瑞金，鐘芳，麻建國譯. 食品化學(xué)（Food Chemistry）第三版 中國輕工業(yè)出版社:124 –226. [11] 張朝武. 現(xiàn)代衛(wèi)生檢驗(yàn) 人民衛(wèi)生出版社出版日期：2005-1-1: 24 - 56. [12]李建武等編. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法 北京大學(xué)出版社，1994。:14 - 26. [13] 胡宏紋編.《有機(jī)化學(xué)》上、下冊，高等教育出版社，2001: 124 – 156. [14]張洪淵等.生物化學(xué)教程（**版），，四川大學(xué)出版社，1994年。:74 -96. [15] 北京師范大學(xué)生物系.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，，高等教育出版社，1999，6，**版。:84 - 126. [16]Voet. D. Biochemistry (2nd edition). John Wiley and Sons. Inc .N. Y. 1995:124- 172. [17]Alberts. B. et . al Molecular biology of the cell(3rd edition) , Garland Publishing .Inc . N. Y.1994 :27 - 86. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
